Подсчет клеток микроорганизмов в счетных камерах
Сущность метода
Метод прямого счета микробных клеток в счетных камерах – один из наиболее быстрых и достаточно точных. Данный метод успешно применяется для определения общего количества микроорганизмов, содержащихся во взвесях. Однако счетные камеры Горяева, Нажотта могут быть использованы лишь для подсчета относительно крупных объектов – клеток водорослей, дрожжей грибов, микроскопируемых при увеличении микроскопа (окуляр 10–15´, объектив 8–40´).
Устройство и подготовка камеры Горяева
Счетная камера Горяева представляет собой толстое предметное стекло с прямоугольным углублением в центре. Глубина камеры составляет 0,1+0,005 мм. На дне углубления нанесена сетка из 400 квадратов. Сторона сетки соответствует 3+0,005 мм, площадь одного малого квадрата соответствует 1/400 мм2, большого – 1/25 мм2.
Каплю с микроорганизмами помещают в центр камеры и накрывают специальным покровным стеклом, тщательно притирая его по краям камеры до появления ньютоновских колец. При этом толщина слоя жидкости в камере над сеткой соответствует 0,1 мм, а объем камеры 0,9 мм3 (около 1мм3). Каждый малый квадрат ограничивает объем жидкости в 1/4000 мм3 , или 1/4000000 мл (1 мл = 1000 мм3).
Подсчет клеток в камере начинают через 3...5 мин. после заполнения ее, когда клетки осели и расположились в одной плоскости. Подсчет клеток ведут обычно в 10 больших либо в 20 малых квадратах, перемещая их по диагонали. Количество клеток в большом квадрате не должно превышать 20, а в малом – 10.
Для получения достоверного результата общее число подсчитанных клеток микроорганизмов должно быть не менее 600, поэтому из исследуемой взвеси микроорганизмов берут 3 – 4 пробы для монтажа камеры.
Материалы и оборудование
– счетная камера Горяева;
– водоструйный насос;
– мембранные фильтры № 5,6;
– колба на 500мл с пробой природной воды;
– склянка на 20мл из-под пенициллина;
– пипетка глазная;
– микроскоп;
– кисточка колонковая;
– формалин 40%.
Проведение анализа
Пробу природной воды содержащей водоросли, объемом 500 мл, сгущают с помощью водоструйного насоса на мембранном фильтре. В конце фильтрования необходимо следить, чтобы над фильтром остался тонкий слой воды. Затем сгущеный осадок с фильтра осторожно переносят в склянку при помощи кисточки и доводят до объема 5мл дистиллированной водой. Консервируют препарат формалином или раствором Люголя.
После тщательного взбалтывания, каплю взвеси с водорослями из склянки наносят в центр счетной камеры пипеткой. Счетную камеру накрывают покровным стеклом, тщательно притирая его с краев до образования ньютоновских колец (цветных полос).
Подсчет клеток в камере начинают через три – пять минут после ее заполнения, когда клетки осели и расположились водной плоскости. Подсчет клеток ведут обычно в 10 больших либо в 20 малых квадратах, перемещая их по диагонали.
Для статистической достоверности в каждой пробе необходимо определить и просчитать все виды не менее трех раз с последующим вычислением среднего арифметического. Пересчет общей численности производится по формуле
(50)
где N – число клеток в 1 мл воды, n – число клеток в камере объемом 1мм3;
v1 – объем концентрата пробы (5 мл);
v2 – объем камеры в мл (0,001);
w – объем профильтрованной воды (500 мл);
Отчет по работе должен содержать:
– расчет общей численности водорослей;
– расчет численности доминирующих видов;
– рисунки часто встречающихся видов.
* Тимолфталеин используют при титровании очень слабых кислот и катионов очень слабых оснований
* Если анализируют сточную воду, ее разбавляют стерильной водой в несколько раз.
** Вся применяемая посуда должна быть стерильной.
* Фильтровальный аппарат стерилизуют кипячением в течение 30—40 мни, а ультрафильтры—в течение 10 мин.